類器官、細(xì)胞球與3D細(xì)胞培養(yǎng)在疾病模型與再生醫(yī)學(xué)研究中展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。然而，手動統(tǒng)計(jì)仍然是大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行3D細(xì)胞研究時(shí)所采用的常規(guī)手段，這種方法不僅耗費(fèi)大量時(shí)間與人力，在統(tǒng)計(jì)3D結(jié)構(gòu)尺寸時(shí)也容易受到人為因素干擾而造成誤差。本期的小C講堂，將為大家?guī)鞢orning細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Corning Cat. No. 6749)與類器官計(jì)數(shù)軟件(Corning Cat. No. 6749-OC)自動化計(jì)數(shù)解決方案，可以快速精準(zhǔn)地獲取3D細(xì)胞球的數(shù)量與尺寸數(shù)據(jù)。

細(xì)胞球的建立

MRC5細(xì)胞在康寧 Elplasia? 球面底6孔板（Corning Cat. No. 4440）中培養(yǎng)成球。培養(yǎng)板底部有多個(gè)超低吸附表面的微腔，支持每孔形成多達(dá)2885個(gè)尺寸一致的細(xì)胞球。在本研究中我們設(shè)置了3組細(xì)胞濃度，使每個(gè)微腔中MRC5細(xì)胞的起始平均分布各有50、100和200個(gè)（每孔起始細(xì)胞數(shù)分別為1.44 x 106、2.89 x 106或 5.77 x 106個(gè)）用于形成不同尺寸（定義為小、中和大）的細(xì)胞球。如圖1所示，細(xì)胞接種后在37°C 和 5% CO2 條件下培養(yǎng)2天，即可在微腔中形成細(xì)胞球。

圖1. 經(jīng)過兩天的培養(yǎng)后，康寧 Elplasia? 板中形成的尺寸一致的細(xì)胞球

細(xì)胞球計(jì)數(shù)

細(xì)胞球懸液制備：將兩個(gè)孔中獲得的細(xì)胞球（約5000個(gè)）轉(zhuǎn)入15 mL 離心管中，以 200 x g 離心 3 分鐘，棄掉上清并用 100 μL 的 PBS重懸。

Corning細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Corning Cat. No. 6749）與類器官計(jì)數(shù)軟件（Corning Cat. No. 6749-OC）一起用于自動計(jì)算球體的濃度和大小。將20 μL 細(xì)胞球懸液加入到3D counting chamber (Corning Cat. No. 480201)中，置于載物臺上進(jìn)行分析。3D counting chamber深度為0.2 mm，適配直徑20– 200 μm的細(xì)胞球體結(jié)構(gòu)?？祵幾詣踊鉀Q方案為用戶提供了兩種基于圖像算法的操作選項(xiàng)，以分別應(yīng)對不規(guī)則的3D結(jié)構(gòu)和規(guī)則的球形結(jié)構(gòu)，此處示例為球形結(jié)構(gòu)圖像計(jì)算方案。

手動統(tǒng)計(jì)是將 10 μL細(xì)胞球懸液加入 384 孔高內(nèi)涵成像微孔板（Corning Cat. No. 4681）中，在顯微鏡下仔細(xì)觀察、計(jì)數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞球濃度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Corning細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的圖像分析算法能夠準(zhǔn)確識別不同尺寸的細(xì)胞球（圖2）。

圖2. 使用Corning細(xì)胞計(jì)數(shù)儀自動計(jì)數(shù)與手動計(jì)數(shù)的典型圖。（A-C）每個(gè)微腔50個(gè)細(xì)胞形成的細(xì)胞球；（D-F）每個(gè)微腔100個(gè)細(xì)胞形成的細(xì)胞球；（G-I）每個(gè)微腔200個(gè)細(xì)胞形成的細(xì)胞球；（A, D, G）計(jì)數(shù)前細(xì)胞球的明場圖像；（B, E, H）使用圖像分析算法分析細(xì)胞球的明場圖像；（C, F, I）顯微鏡下 384 孔微孔板中細(xì)胞球的明場圖像

相較于手動計(jì)數(shù)法，Corning細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算得出的細(xì)胞球濃度更加接近于理論值（圖3），而兩種方法測量出的細(xì)胞球的直徑?jīng)]有顯著差異（圖4）。

圖3. 細(xì)胞球濃度統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖4. 細(xì)胞球直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果

結(jié)論

Corning細(xì)胞計(jì)數(shù)儀類器官計(jì)數(shù)軟件可以快速且精準(zhǔn)地統(tǒng)計(jì)類器官或細(xì)胞球等3D結(jié)構(gòu)的數(shù)量與尺寸，可以完美代替?zhèn)鹘y(tǒng)的手工計(jì)數(shù)方法，既省時(shí)省力，又節(jié)約實(shí)驗(yàn)耗材。

Corning細(xì)胞計(jì)數(shù)儀類器官計(jì)數(shù)軟件所提供的圖像分析方法，能在應(yīng)用范圍內(nèi)準(zhǔn)確識別出不同尺寸的不規(guī)則類器官或規(guī)則的細(xì)胞球，從而為使用者直接提供類器官的數(shù)據(jù)。